Membrane is one of the main components of a living cell. It is involved in a variety of vital processes, including respiration, transport of nutrients, signaling, and enzymatic reactions. Integral and peripheral membrane proteins, such as receptors, transporters, ion channels, various enzymes that are directly involved in maintaining cell homeostasis and their reception of external and intercellular signals, are responsible for most of these functions. Up to 30% of all protein sequences encoded in the genomes of various organisms correspond to membrane proteins, and many socially significant diseases are associated with their dysfunction and mutations. Moreover, over half of currently known drugs directly affect the activity of membrane proteins. Therefore, it is not surprising that membrane proteins are among the most important objects for the pharmacological development of modern "targeted" drugs and early diagnostics. At the same time, membrane proteins are rather poorly studied from the point of view of the spatial structure, dynamics and intermolecular interactions, which is caused by technical problems associated with the heterogeneity of the membrane environment, their dimerization/oligomerization and the presence of disordered parts, causing a high relative mobility of subdomains. Directed design of biologically active compounds requires a deep understanding of the structural and dynamic organization and functioning of their protein targets that in many cases are localized inside or on the surface of biological membranes. The main achievements in this area are provided by X-ray crystallography and are presented by the studies of porins, ion channels, G-protein coupled receptors, as well as individual (including water-soluble) domains of membrane proteins. However, crystallization of membrane proteins leads to the loss of information on conformational mobility and makes it impossible to study the influence of the membrane environment on their structure, dynamics, and function. The fast-developing method of Cryo-Electron Microscopy allows obtaining the structure of full-length proteins and their complexes, including membrane proteins with a sufficiently high resolution. However, this method also has its own limitations when working with membrane proteins with high intramolecular motility (such as type I receptors with extracellular and cytoplasmic globular domains connected by flexible loops to transmembrane segment). Moreover, now there is no modern experimental base in Russia to use this method. Thus, both structural methods mentioned above should be combined with other methods of structural biology, allowing obtaining detailed experimental structural and dynamic information for proteins. Therefore, the development of new complex techniques for structural-dynamic studies based on the integration of complementary experimental and theoretical (computational) methods of structural biology, such as NMR spectroscopy, protein engineering, optical spectroscopy and computer modeling, is a modern trend contributing to obtaining unique data on the link between structure and function of membrane and membrane-active proteins. Heteronuclear NMR spectroscopy is a unique method that allows one to obtain experimental information about the structure, dynamics, and intermolecular interactions for peptides and proteins that often contain mobile segments and perform the biological function in a heterogeneous environment. Modern methods of protein engineering allow obtaining samples of membrane proteins and their fragments (including isotope-labeled derivatives) from various biological systems in sufficient quantities for structural studies. Using optical microscopy and spectroscopy it is possible to characterize protein samples, as well as to obtain experimental information about intermolecular interactions and structural and functional properties of protein compounds at the molecular and cellular levels. Computer modeling helps to investigate at the atomic level the structure and dynamics of proteins and membranes, to reveal their interactions when performing a biological function. The complexity of the project is also provided by the choice of objects that belong to different protein families and performing different functions. This will allow to establish general fundamental principles of biological activity, as well as to identify unique molecular mechanisms for membrane proteins from different families. At the same time, the study of a set of objects, that sufficiently cover a wide range of biological functions, has more chances for the successful development of new ligand molecules to membrane proteins. Thus, the fundamental knowledge about the structure-dynamics-function relationship for membrane proteins of various families obtained as a result of this project will be most successfully used to create pharmacological compounds with a given specificity and targeted delivery to certain membrane systems for adequate therapy and early diagnosis of socially significant diseases. In the course of the project, using modern methods of structural biology we plan: (1) to establish the allosteric molecular mechanisms of signal transduction through the cell membrane of type I receptors (including those from the tumor necrosis factor receptor superfamily and receptor protein kinases), to identify structural and functional determinants for the development of new generation targeted medicinal compounds for the treatment and diagnosis of cancer, inflammatory, cardiovascular, and neurodegenerative diseases; (2) to describe the intermolecular mechanisms of interaction of natural peptide toxins (from venoms) with mammalian potassium channels (Kv channels) in comparison with small-molecule compounds for the development of a new generation of high-affinity potassium channel blockers and modulators; (3) to investigate the molecular mechanisms of penetration through the lipid membrane for ribosome-inactivating protein toxins (from plants) that inhibit protein synthesis in eukaryotic cells due to catalytic damage to their ribosomes, to develop antitumor compounds and methods for their delivery into the cell; (4) to develop new methods of visualization of intermolecular interactions observed in the functioning of membrane proteins, and the creation of modern diagnostic tools based on bioluminescence to determine the structural and dynamic mechanisms of the new luciferin-luciferase systems (from animals and fungi). New knowledge gained while working on each of these areas will have a synergistic effect on other tasks and the implementation of the entire project. A wide range of research objects and the fulfilling of appointed tasks will contribute to the development of new technologies for the study of membrane proteins and membrane systems, as well as provide a deep understanding of the various processes occurring in biological membranes. The use of an integrated approach will provide fundamentally new information on the structure-activity relationship for several promising classes of pharmacological targets. Ultimately, this will serve as the basis for biomedical applications in the field of diagnostics and treatment, as well as allow the use of membrane and membrane-active proteins as prototypes for creating nano-biotechnological devices for controlling cellular processes in the body. The proposed integrated approach is a new stage in the development of structural biology methods; it illustrates the gradual shift from the previously widely adopted “structure-function“ paradigm to the modern ideology, which takes into account the essential role of environment and conformational plasticity in the functioning of membrane proteins.
Мембраны, являясь одним из основных компонентов живой клетки, участвуют во множестве жизненно важных процессов, включая, дыхание, транспорт питательных веществ, передачу сигналов и проведение ферментативных реакций. За большинство из этих функций ответственны интегральные и периферические мембранные белки, такие как рецепторы, транспортеры, ионные каналы, разнообразные ферменты, которые непосредственно участвуют в поддержании гомеостаза клеток и рецепции ими внешних и межклеточных сигналов. До 30% всех белковых последовательностей, закодированных в геномах различных организмов, соответствуют мембранным белкам, а с их дисфункцией и мутациями связаны многие социально-значимые заболевания организма человека. При этом свыше половины известных в настоящее время лекарственных препаратов напрямую воздействуют на активность мембранных белков. Поэтому не удивительно, что одними из наиболее важных объектов для фармакологических разработок современных «таргетных» лекарственных препаратов и средств ранней диагностики являются именно мембранные белки. В то же время, мембранные белки достаточно плохо изучены с точки зрения пространственной структуры, динамики и межмолекулярных взаимодействий, что обусловлено техническими сложностями, связанными с гетерогенностью мембранного окружения, их димеризацией/олигомеризацией и наличием в них неупорядоченных участков, обусловливающих высокую относительную подвижность субдоменов. Направленное конструирование биологически-активных соединений требует глубокого понимания структурно-динамической организации и функционирования их белковых мишеней во многих случаях локализованных внутри или на поверхности биологических мембран. Основные достижения в этой области обеспечены методом рентгеноструктурного анализа и представлены результатами исследования ряда поринов, ионных каналов, трансмембранных рецепторов, связанных с G-белками, а также отдельных (в том числе водорастворимых) доменов мембранных белков. Однако кристаллизация мембранных белков приводит к потере информации о конформационной подвижности и делает невозможным исследование влияния свойств мембранного окружения на их структуру, динамику и функцию. Быстроразвивающийся метод электронной криомикроскопии позволяет получить структуру полноразмерных белков и их комплексов, в том числе мембранных белков с достаточно высоким разрешением. Но данный метод также ограничен в применении при работе с мембранными белками, обладающими высокой внутримолекулярной подвижностью (такими как рецепторы типа I, имеющими внеклеточные и цитоплазматические глобулярные домены связанные гибкими участками одним трансмембранным сегментом). К тому же на данный момент в России нет современной экспериментальной базы по применению данного метода. Таким образом, оба структурных метода необходимо комбинировать с другими методами структурной биологии, позволяющими получить детальную экспериментальную структурно-динамическую информацию о белках. Поэтому разработка новых комплексных методик для структурно-динамических исследований на основе интеграции взаимодополняющих экспериментальных и теоретических (вычислительных) методов структурной биологии, таких как спектроскопия ЯМР, белковая инженерия, оптическая спектроскопия и компьютерное моделирование является актуальным трендом, способствующим получению уникальных данных о взаимосвязях между структурой и функцией мембранных и мембраноактивных белков. Гетероядерная спектроскопия ЯМР является уникальным методом, позволяющим получить экспериментальную информацию о структуре, динамике и межмолекулярных взаимодействиях для пептидов и белков, зачастую имеющих подвижные участки и выполняющих биологическую функцию в гетерогенном окружении. Современные методы белковой инженерии позволяют в достаточном количестве для структурных исследований получить препараты мембранных белков и их фрагментов (в том числе изотопно-меченые производные) из различных биологических систем. С помощью оптической микро- и спектроскопии возможно охарактеризовать белковые препараты, а также получить экспериментальную информацию о межмолекулярных взаимодействиях и структурно-функциональных свойствах белковых соединений на молекулярном и клеточном уровнях. Компьютерное моделирование помогает исследовать на атомарном уровне структуру и динамику белков и мембран, детализировать их взаимодействия при выполнении биологической функции. Комплексность проекта обеспечивается также выбором в качестве объектов исследования мембранных белков, принадлежащих разным семействам и выполняющих разные функции. Это позволит установить общие фундаментальные принципы биологической активности, так и выявить уникальные молекулярные механизмы для мембранных белков из различных семейств. В то же время исследование набора объектов, в достаточной мере покрывающий широкий спектр биологических функций, имеет больше шансов на успешную разработку новых молекул лигандов к мембранным белкам. Таким образом, полученные в результате выполнения проекта фундаментальные знания о взаимосвязи структура-динамика-функция для мембранных белков различных семейств будут наиболее успешно задействованы при создании фармакологических соединений с заданной специфичностью и направленной доставкой к определенным мембранным системам для адекватной терапии и ранней диагностики социально-значимых заболеваний.
В ходе выполнения проекта современными методами структурной биологии планируется:
Новые знания, полученные в ходе работы по каждому из этих направлений будут иметь синергический эффект для решения других задач и выполнения всего проекта в целом. Широкий выбор объектов исследования и выполнение поставленных задач будет способствовать развитию новых технологий исследования мембранных белков и мембранных систем, а также обеспечит глубокое понимание разнообразных процессов, происходящих в биологических мембранах. Применение комплексного подхода обеспечит получение принципиально новой информации о фундаментальной взаимосвязи структура-активность для нескольких перспективных классов фармакологических мишеней. В конечном итоге это послужит основой для биомедицинских приложений в сфере диагностики и лечения, а также позволит использовать мембранные и мембраноактивные белки в качестве прототипов для создания нано-биотехнологических устройств для управления клеточными процессами в организме. Предлагаемый комплексный подход является новым этапом в развитии методов структурной биологии и иллюстрирует постепенное смещение акцентов с ранее принятой парадигмы структура-функция, на современную систему взглядов, принимающую во внимание неотъемлемую роль окружения и конформационной пластичности в функционировании мембранных белков.